产品货号：
SN0068
中文名称：
快速克隆试剂盒(拓扑异构酶)
英文名称：
Simple Cloning Kit
产品规格：
20T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
产品特点：
产品组成：
保存：-20℃，有效期1年。
注意事项：
操作示例：
常见问题：
附录参考：
pTOPO2载体图谱：
相关搜索：快速克隆试剂盒(拓扑异构酶)，Simple Cloning Kit
本制品是基于拓扑异构酶(Topoisomerase)能够快速高效连接DNA片段的原理，结合特殊生产工艺制成的一款快速TA克隆试剂盒，可高效替代基于T4连接酶的传统克隆。本制品适用于10kb以内DNA片段的TA克隆。
本试剂盒中包含的pTOPO2 Simple Vector在插入位点两侧不含多克隆酶切位点，可有效连接10kb以内DNA片段，并利用自杀基因零背景技术，解决了载体自连造成的假阳性困扰，无需繁琐的蓝白斑筛选操作，阳性率高达95%。
产品特点：
- 快速连接：5min内完成连接反应。
- 长短片段均适用：可连接10kb以内DNA片段。
- 低背景：利用自杀基因零背景技术，可见即有插入，阳性率高达95%。
产品组成：
| 组分 | 规格 |
| pTOPO2 Simple Vector (30ng/μL) | 20μL |
| Control Template (1000bp,30ng/μL) | 5μL |
| 10×Topo Buffer | 20μL |
保存：-20℃，有效期1年。
注意事项：
- 目的片段的PCR引物不能磷酸化；
- PCR产物建议进行胶回收纯化，避免非特异性扩增和引物二聚体的影响。
纯化后，对回收产物进行琼脂糖凝胶电泳确定产物浓度。 - 连接反应不能在冰上进行，请严格按照说明书推荐温度进行。
- 请勿使用耐受ccdB自杀基因的感受态转化，推荐使用常规的DH5α或TOP10感受态。
- 测序时使用引物：M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)，请勿使用引物M13F(-47)/M13R(-48)。
操作示例：
- PCR产物的准备
- 引物要求：引物不能磷酸化。
- 产物末端：需末端带“A”碱基，用能在PCR产物末端加一个突出的“A”的Taq DNA聚合酶扩增。
- 产物纯化：对PCR产物进行凝胶回收纯化，电泳检测回收产物浓度后再进行连接反应。
- 引物要求：引物不能磷酸化。
- 反应体系的配制
- 按下表配制10μL反应体系：
成分 用量 纯化后的PCR产物a/Control Templateb 0.5～8μL pTOPO2 Simple Vector 1μL 10×Topo Buffer 1μL ddH2O 至10μL 此步骤需在室温(20～30℃)进行，不能在冰上进行！- 不同大小插入片段的推荐用量：
插入片段大小(bp) 推荐用量(ng) 100～1000 10～40 1000～2000 40～80 2000～5000 80～150 - 若需要设置对照组实验，可加入1μL Control Template(1000bp,30ng/μL)。
- 不同大小插入片段的推荐用量：
- 将所有组分轻轻吹打混匀，低速离心收集至管底。
- 按下表配制10μL反应体系：
- 连接反应
将上述连接体系置于PCR仪或金属浴中(20～30℃)反应5min，反应完成后立即转化，请勿置于冰上或冰箱中，否则会降低连接效率。 - 转化
- 取100μL冰浴上融化的感受态细胞，加入10μL连接产物，轻柔混匀，冰上静置30min。
- 42℃水浴热激45s，迅速冰上静置2min(注意不要晃动离心管，以免降低转化效率)。
- 向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌培养基(2×YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏1h(小片段等简单连接可适当缩短复苏时间)。
- 根据实验需求吸取不同体积的感受态细胞加到含有相应抗生素的2×YT或LB固体培养基上，均匀涂开后吹干平板，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
- 取100μL冰浴上融化的感受态细胞，加入10μL连接产物，轻柔混匀，冰上静置30min。
- 阳性克隆的鉴定
- 菌液/菌落PCR检测(3k以内片段推荐)：用枪头挑取白色单菌落到10μL的无菌水中混匀后取1μL为模板，或直接蘸取菌落至PCR体系中进行扩增。推荐使用载体通用引物(M13F和M13R)。
- 以质粒为模板PCR检测(3k以上片段推荐)：挑取单克隆接种于LB/Amp培养基中，37℃ 250rpm过夜摇菌后抽提质粒，以质粒为模板，使用载体通用引物(M13F和M13R)或片段特异性引物进行扩增。
- 限制性酶切分析(可选)：挑取单克隆接种于LB/Amp培养基中，37℃ 250rpm过夜摇菌后提取质粒，使用相应内切酶进行酶切，电泳检测酶切片段大小。
- 测序：使用M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)及M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)进行测序，请勿使用引物M13F(-47)/M13R(-48)。
- 菌液/菌落PCR检测(3k以内片段推荐)：用枪头挑取白色单菌落到10μL的无菌水中混匀后取1μL为模板，或直接蘸取菌落至PCR体系中进行扩增。推荐使用载体通用引物(M13F和M13R)。
常见问题：
- 克隆数少或不长克隆？
- 连接片段纯度差。PCR产物建议胶回收纯化，电泳或仪器检测胶回收产物浓度后再进行连接反应。不推荐多管样品过一个柱子的方式回收DNA，会造成更多的EDTA、胍盐等杂质残留，抑制反应。用于连接反应的胶回收产物请勿使用TE进行保存。
- 连接片段用量过多或过少。请严格按照说明书推荐的用量进行体系配制。
- 连接体系置于冰上配制。低温会降低Topo酶连接效率，需在室温配制反应体系。建议即连即转，请勿置于冰上或冰箱。
- 转化操作不当。请严格按照本说明书或相应感受态说明书转化流程（注意热激温度和热激时间）进行实验。
- 感受态效率低。自制感受态随着保存时间的增加，效率可能会降低，建议尽量使用新鲜感受态或高效商业化感受态。
- 平板抗性使用错误。载体抗性为Amp，推荐使用浓度为100μg/mL。
- 连接片段纯度差。PCR产物建议胶回收纯化，电泳或仪器检测胶回收产物浓度后再进行连接反应。不推荐多管样品过一个柱子的方式回收DNA，会造成更多的EDTA、胍盐等杂质残留，抑制反应。用于连接反应的胶回收产物请勿使用TE进行保存。
- 多数克隆不含插入片段？
- PCR产物中含较多非特异性扩增产物。建议优化引物及PCR条件，提高产物特异性；PCR产物需要切胶纯化；非特异小片段包裹在目的条带中未分离，使用低浓度琼脂糖凝胶、低电压长时间电泳分离；通过增加鉴定的克隆数量来筛选阳性克隆子。
- 环境污染引入杂片段。建议定期更换电泳液、清洁切胶仪器、使用灭菌的实验耗材等，可使用核酸清洁剂清洁实验环境。
- 在错误的紫外波长下切胶。建议在长波（365nm）紫外条件下切胶（时间不宜超过5min），短波（254nm）紫外易造成DNA损伤。
- PCR产物中含较多非特异性扩增产物。建议优化引物及PCR条件，提高产物特异性；PCR产物需要切胶纯化；非特异小片段包裹在目的条带中未分离，使用低浓度琼脂糖凝胶、低电压长时间电泳分离；通过增加鉴定的克隆数量来筛选阳性克隆子。
- 阳性克隆送测，目的片段两端碱基缺失或突变？
- 使用的酶类制品保真度低。建议更换保真度较高的PCR酶类进行扩增。
- 引物质量欠佳。化学合成的引物存在一定碱基缺失或突变的机率，建议多挑克隆或重新合成引物。
- PCR反应没有充分延伸。建议延长终延伸时间。
- 在错误的紫外波长下切胶。建议在长波（365nm）紫外条件下切胶，切胶时间不宜超过5min。
- 使用的酶类制品保真度低。建议更换保真度较高的PCR酶类进行扩增。
附录参考：
pTOPO2载体图谱：
相关搜索：快速克隆试剂盒(拓扑异构酶)，Simple Cloning Kit